熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標(biāo)本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發(fā)標(biāo)本內(nèi)部的熒光物質(zhì)。我們之所以能觀察到標(biāo)本，是由于光源的照射，而是標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能后呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

熒光顯微鏡的原理是什么?

與普通光學(xué)顯微鏡不同，熒光顯微鏡不是通過普通光源的照射來觀察標(biāo)本，而是利用一定波長的光（通常是紫外光、藍紫光）在顯微鏡下激發(fā)標(biāo)本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，所以，熒光顯微鏡光源的作用不是直接照射，而是作為能量源激發(fā)標(biāo)本內(nèi)部的熒光物質(zhì)。我們之所以能觀察到標(biāo)本，是由于光源的照射，而是標(biāo)本中的熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光能后呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象。

由此可見，熒光顯微鏡的主要特點是它的光源可以在特定波長范圍內(nèi)提供大量的激發(fā)光，使被測樣品中的熒光物質(zhì)能夠獲得被測物的激發(fā)光。必要的強度。同時，熒光顯微鏡必須有相應(yīng)的濾光系統(tǒng)。

熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的重要工具。它由超高壓光源、濾光系統(tǒng)（包括激發(fā)和加壓濾板）、光學(xué)系統(tǒng)和照相系統(tǒng)等主要部件組成。它利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。

激發(fā)熒光的方式：根據(jù)光的波長范圍分為UV激發(fā)法（使用紫外照射法）和BV激發(fā)法（使用藍紫光）。紫外激發(fā)法使用短于 400 nm 的近紫外光進行激發(fā)。該方法沒有可見的激發(fā)光，因此觀察到的熒光表現(xiàn)出染料的固有熒光，很容易區(qū)分標(biāo)本上的特異性熒光和背景組織的自發(fā)熒光。

BV激發(fā)法是從紫外光激發(fā)到以404nm和434nm為中心的藍光。這種方法使用藍光照射標(biāo)本，因此熒光觀察系統(tǒng)的截止濾光片必須使用能夠完全阻擋藍光并完全通過所需的綠色和黃色熒光的濾光片。用于熒光抗體測定的熒光染料。激發(fā)光的Z大吸收波長與熒光的Z大發(fā)射波長比較接近，所以BV激發(fā)法中使用的濾光片必須使用銳截止濾光片。該方法可以使用藍光作為激發(fā)光，因此熒光染料的吸收效率高，可以獲得更亮的圖像。缺點是500nm以下看不到熒光，500nm以上會使整個圖像呈現(xiàn)黃色。在熒光抗體法中，大部分熒光染料都是獨特的。因此，在討論細微特異性時，上述 BV 激發(fā)方法的缺點往往影響很大。

綜上所述，熒光顯微鏡的照明根據(jù)聚光鏡的結(jié)構(gòu)和激發(fā)光的波長可以分為以下三點。

1.從熒光圖像的對比度要求來看，紫外激發(fā)的暗場聚光鏡適合照明。

2.考慮到圖像的亮度，BV激發(fā)濾光片的暗場觀察效率高。

3.UV激發(fā)濾光片暗場觀察和BV激發(fā)暗場聚光鏡照明的特點可以說是介于這兩種照明方式之間，但前者的濾光片暗場特性更強，顯示的圖像更亮，對比度小；后者保留了暗場光路的特性，因此顯示圖像更暗，對比度提高。實際使用熒光顯微鏡時，應(yīng)使用適合標(biāo)本要求的照明方法進行觀察。

必須指出的是，即使是用對比度好的紫外激發(fā)暗場聚光器照射時，被試樣折射或散射的部分紫外激發(fā)光也會進入物鏡，使加膠面和光學(xué)玻璃中的加膠面光學(xué)系統(tǒng)會受到激發(fā)的影響，產(chǎn)生的自發(fā)熒光會使圖像的響應(yīng)變差。因此，必須在目鏡前使用吸收紫外線的濾光片作為截止濾光片。